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徕卡共聚焦课堂第七讲:活细胞成像技术

发布:徕卡显微系统(上海)贸易有限公司
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可视化生命分子动力学


理解复杂而快速的细胞动力学是探索生物过程的重要一步。当今的生命太阳城下载下载地址苹果版越来越关注实时动态过程,如细胞迁移,细胞、器官或整个动物的形态变化以及活体标本的实时生理事件(例如细胞内离子组分的变化)。解决这些挑战性需求的一种方式是采用被统称为活细胞成像的光学方法。


活细胞成像实时提供细胞或生物体在其自然环境中的当前状态的“快照”,而不会人为引入一些假象。这些特点让活细胞成像成为解决细胞生物学、癌症研究、发育生物学和神经科学问题的必要技术。


近年来,电子学、光学和分子生物学都取得了重大进步,科学家们可以很容易地进行活细胞成像。


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活细胞荧光成像需要考虑如下因素:

维持样品生理条件

在你的实验中要考虑的最重要的事情是在样品准备和成像过程中保持你的样品的活力和健康度。因此,将样品保存在尽可能接近生理条件的环境中是至关重要的,即温度、pH、氧气水平和其他重要因素。


减小光压力

将活细胞暴露在光线下会产生光毒性和标本生理上的变化,所以你可能会得到与正常生理条件下实际发生的情况不同的结果。为了尽可能避免光毒性,宽场显微镜通常是活体标本成像的首 选技术。他们用低剂量的LED光照射样品以激发荧光团,图像采集比其他显微镜方法如共焦成像更快。


样品的标记

太阳城下载下载地址苹果版在对活标本进行成像时,荧光蛋白通常是标记要研究事件发生的标本结构的首 选工具,因为与其他标记相比,这些蛋白质的毒性通常较小,并绕过了抗体无法进入细胞的问题。荧光蛋白质技术依赖于基因编码的荧光团,可用于跟踪活细胞中标记的生物分子及其相互作用等。同时使用多个荧光蛋白,称为多色或多路成像,允许您同步观察多个细胞结构和过程,提供更多生理相关的结果,从而为测量增加背景(例如,使用其他标记进行活/死细胞分析或进行多色小泡观察实验)。


用于活细胞成像的方法

众多显微技术被应用于活细胞成像。通常,细胞的生长、细胞聚集体或细胞运动是通过使用复合显微镜以及像相差和微分干涉 (DIC)这样的方法来观察的。对更大的标本,如发育中的斑马鱼胚胎进行延时成像,通常使用立体显微镜或宏观显微镜。


这篇文章的重 点是荧光显微镜技术,这些技术在过去几十年中变得更加突出。这篇简短的概述涵盖了常用的定量方法,以及宽场显微镜常用的光操作技术


离子成像

观察离子浓度的变化

由于细胞胞浆中的离子组成决定了许多重要的功能,如神经元的兴奋性、基因转录和细胞运动,细胞内离子在空间和时间上的调节是生命太阳城下载下载地址苹果版的主要热点之一。离子成像(钙、氯、镁)是一种常用的方法,它使用荧光染料或特别设计的蛋白质,以改变其在钙结合时的发射行为。这使研究人员能够观察细胞离子浓度的动态变化。此外,使用特殊的荧光染料可以对细胞内的pH值或电压进行成像。一种用来对离子水平、pH值或电压变化进行成像的特殊技术是比率成像法。这些方法能够精确测定细胞内钙浓度等信息,而不像非比率方法那样监测相对变化。


TIRF

观察靠近细胞膜的过程

全内反射荧光(TIRF)是一种特殊的技术,用于观察位于细胞质膜或靠近质膜的事件。通过使用仅穿透细胞60-250 nm的荧光激发的消逝场,TIRF显微镜提供了无与伦比的z轴分辨率,使得能够对发生在质膜内或靠近质膜的事件进行成像,例如,分子向质膜的运输。TIRF避免了被细胞内部更深的分子发出的荧光信号淹没的问题。


TIRF图像

靠近膜的Galectin-3(半乳糖凝集素3)囊泡沿肌动蛋白丝的运输。


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太阳城下载下载地址苹果版图1:A)落射荧光的图像;B)TIRF图像,框选部分详见C部分;C):TIRF成像的时间序列结果;时间以秒为单位。箭头指示靠近膜的Galectin-3囊泡(用YFP标记)首先沿着肌动蛋白丝(从底部向上)运输,转移到另一条肌动蛋白丝(88秒),向左移动(109秒),再向右运输,再次转换肌动蛋白丝,然后向上运输(246秒)。

YFP:红色;CFP:绿色;概览图像的标尺:20 µm;厚度:6 µm;TIRF穿透深度:110 nm。由德国马尔堡大学的Ralf Jacob提供


FRET和BRET

量化蛋白质-蛋白质相互作用

要检测动态蛋白质相互作用,可以在活细胞实验中对FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)事件进行成像。FRET是量化分子动力学的有利工具,如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用和蛋白质构象变化等。FRET成像通常使用GFP(绿色荧光蛋白)的衍生物,尤其是CFP和YFP(分别为青色和黄色荧光蛋白),它们各自使用分子生物学方法连接到感兴趣的目的蛋白质上。然后用相应荧光激发CFP分子。一旦目的蛋白质在空间上接近(<20 nm),CFP将作为供体并以光的形式发射能量转移给作为受体的YFP。研究人员将观察到从CFP发出的蓝色荧光转变为从YFP发出的黄色荧光。使用BRET时,供体是生物发光分子(例如荧光素酶衍生物),与FRET一样,GFP衍生物作为受体


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图2:拟南芥的共聚焦活细胞图像;内质网:GFP标记为绿色,自发荧光叶绿体为红色,透射光为蓝色。基于这样的图像,可以完成FRET或FRAP等分析。


FRAP

监测蛋白质和囊泡转运

光漂白后荧光恢复(FRAP)是一种常用的监测蛋白质或囊泡转运的方法。荧光蛋白(通常是GFP)附着在目的蛋白质上(即要监测此蛋白质的运动)。通常情况下,整个细胞最初发出荧光,因为整个细胞中可能含有丰富的该蛋白质。然后细胞的某个区域,通常是神经元细胞中的细胞突起,如轴突或树突,暴露在高强度的光下(通常是激光),该特定区域的荧光被破坏(漂白)。随着目的蛋白质的移动,来自细胞其他区域的蛋白质会以一定的速度重新侵入漂白区域,然后漂白区域的荧光恢复。这能让研究人员深入了解胞内运输动力学。


光活化

监测基因表达和蛋白质转运

最近开发的一种被称为光活化的方法能够选择性地 标记细胞或整个生物体内的特定区域或感兴趣区域。进行光活化时,使用专门设计的染料或荧光蛋白,如光活化绿色荧光蛋白(paGFP)或Kaede。这些荧光团在正常状态下不发荧光。但在用特定波长的光照射后,它们可以像传统荧光团一样被激活,发出荧光。在很多情况下,将这些蛋白质与某些目的蛋白质进行基因融合,可以监测其表达或转运。然后可以应用FRAP或粒子跟踪等方法来进一步研究目的蛋白质。


MPE

深入研究进程

在细胞培养实验中,现代生物学研究需要真正的体内研究来补充“类似体内”研究。但很难研究像小鼠这样的生物体内发生的过程。多光子激发(MPE)显微镜能够更深入地穿透组织太阳城下载下载地址苹果版,因为与用于单光子激发的短波长光相比,近红外激发光具有更长的波长,散射更少。MPE技术的非线性特性将光漂白和光毒性限制在焦点区域。这对长期研究非常有益,因为荧光蛋白和生物体都受到这些问题的困扰。据报告,使用合适的标本和显微镜设置,成像深度可以深入组织中数毫米。激发的精确定位使其也适用于光子操纵。该方法在神经生物学中得到了广泛的应用。


FLIM

活细胞的空间测量

荧光寿命成像的优点是数据不依赖于信号强度。因此不受光漂白和浓度变化等常见伪影的影响。使用时间相关的单光子计数,通过单分子检测数据重建FLIM图像。可以记录和分析亚纳秒荧光寿命的最小变化。该方法可用于研究导致荧光寿命改变的任何类型的细胞外和细胞内环境改变。基于FLIM的FRET分析对发射强度不敏感,从而提高了定量数据的精度。


CARS和SRS

使用振动对比的无标记方法

几乎所有的活细胞荧光成像方法都基于荧光蛋白的基因表达。这涉及到大量的技术工作和高昂的费用。此外,外部基因的表达可能会改变微环境,从而导致数据与实际生理学情况的差异。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜和受激拉曼散射(SRS)显微镜是不依赖于荧光染料的非线性共聚焦方法。这些无标记方法可对样品中特定化学键的振动状态进行成像。生物体中特定化学键的积累,例如轴突周围髓鞘中的脂质,可以在无需染色的情况下以高分辨率和出色的信噪比质量进行成像。


未来需要更多的定量分析 


生物学研究已经从单纯的描述性调查进入到定量分析的时代。新的活细胞成像技术正在朝着更高分辨率的方向发展太阳城下载下载地址苹果版,无论是在空间上还是在时间上。技术发展现在正集中于对动态事件的定量研究,使这些方法更容易获得,并为充分回答研究问题奠定了基础。


2022-05-09
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